Foi estudada a expressão da ACC oxidase em maçãs, cv. Jonagold, colhidas no estádio pré-climatérico e armazenadas sob refrigeração em atmosfera normal (0ºC, 95% UR - AN) e controlada (0ºC, 95% UR, 1,5% O2 e 2,5% CO2 - AC), durante 180 dias. Na instalação do experimento, aos 90 e aos 120 dias, foram coletadas amostras para a determinação da firmeza de polpa, da acidez total titulável, dos sólidos solúveis totais, da produção de etileno, da atividade ACC oxidase e para a detecção imunoquímica das isoformas desta enzima. A dosagem da atividade ACC oxidase foi realizada por cromatografia gasosa a partir de extrato protéico solúvel acrescido de 250µM de ACC, 10µL de sulfato ferroso e 30µL de ascorbato de sódio. Para a detecção imunoquímica utilizou-se a técnica "western blot", com anticorpos policlonais anti-ACC oxidase de maçã, após separação das proteínas em eletroforese e isoeletrofocalização. Não foi detectada ACC oxidase em maçãs pré-climatéricas. Porém, após 120 horas em condições ambientais, houve a síntese dessa enzima e um incremento na produção de etileno. A refrigeração não exerceu controle na síntese da ACC oxidase e produção de etileno, resultando em significativas perdas físico-químicas nas frutas armazenadas em AN. Já a utilização de AC permitiu controlar a via de biossíntese do etileno, pela inibição da síntese da ACC oxidase, mantendo o material com boa qualidade para o consumo in natura. A adição de ACC e dos cofatores aumentou a atividade ACC oxidase e alterou o pI da ACC oxidase.

This experiment was carried out to evaluate the inhibition of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) oxidase in apple fruits by controled atmosphere. Jonagold apples were stored in normal atmosphere (NA) and controlled atmosphere (CA) storage. The fruits were harvested at the preclimateric stage and stored for 120 days at 0ºC and 95±5% RH with O2 set to 1,5% and CO2 set to 2,5% (CA) or without gas control (NA). At 90 and 120 days after harvesting, samples were collected to study the ethylene production by gas chromatography, ACC oxidase activity by gas chromatography and immunoblotting protein characterization by western blot, using specific polyclonal antibodies against ACC oxidase from apple fruit. Nevertheless, ACC oxidase was detected and the ethylene production was increased for those fruits stored by 120 hours under room temperature. Apples stored in NA did not control the ethylene production and ACC oxidase synthesis. However, apples stored in CA had the ethylene biosynthesis controlled and showed an ACC oxidase synthesis inhibited. In climacteric apples, the ACC oxidase activity increased by ACC, Fe+2 and ascorbat addition in the enzymatic extract. Protein analysis by isoelectricfocusing showed three proteins with pIs 5.95, 5.87 and 5.78. Those with smallers pIs were detected in the presence of substrate and cofactors.

Com o objetivo de caracterizar, por via imunoquímica, a enzima ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase em frutos climatéricos, foram preparados anticorpos policlonais específicos para esta proteína. Utilizou-se, como antígeno, uma proteína recombinante, produzida em Escherichia coli K38/pGP1,2, contendo o vetor de expressão pT7-7A4 no qual foi inserido um clone de DNA da ACC oxidase. A especificidade dos anticorpos foi demonstrada pela técnica de "Western blot", a partir de extratos protéicos de maçãs e tomates em diferentes estágios de maturação. Verificou-se que o aumento da produção de etileno, quando os frutos passaram do estágio pré-climatérico para o climatérico, está diretamente correlacionada com o aumento da síntese da ACC oxidase. Em estágios de maturação mais avançados houve uma redução da produção de etileno e da atividade ACC oxidase, mas esta proteína continuava presente. Quando o "Western blot" foi realizado com tomates transgênicos, onde a produção de etileno e a síntese da ACC oxidase foram inibidos em mais de 95%, nenhuma reação imunoquímica foi detectada. O conjunto de resultados obtidos indica que os anticorpos detectam especificamente ACC oxidase.

Polyclonal antibodies were prepared to characterize the enzyme ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxilic acid) oxidase from climateric fruits. The antigen was a recombinant protein obtained from an Escherichia coli K38/pGP1,2, which contained the expression vector pT7-7A4 with one ACC oxidase DNA clone inserted. Antibody specificity was demonstrated by the Western blot technique with protein extracts from apples and tomatoes in different maturation stages. It was observed that the increase in ethylene production which happened when the fruits changed from pre-climateric to climateric stage is directly correlated with an increase in ACC oxidase syntesis. In more advanced maturation stages there was a reduction in ethylene production and ACC oxidase activity, however the protein was still present. There was no immunochemical reaction in Western blot performed with transgenic tomatoes, which had a 95% reduction of etylene production and ACC oxidase syntesis. This results suggest that the antibodies detects ACC oxidase specifically.